(一)污染清除方法
培養(yǎng)細胞一經(jīng)污染,多數(shù)較難處理。如果污染細胞價值不大,宜棄之;在尋找原因后*消毒操作室,復(fù)蘇或重新購置細胞,再培養(yǎng)。
污染細胞價值較大,又難于重新得到,可采取以下辦法清除。
1. 細菌和真菌的清除
抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。
預(yù)防用藥一般用雙抗生素,污染后清除用藥需采用大于常用量5~10倍的沖洗法,于加藥后作用24~48小時,再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。
2. 支原體的清除
(1) 用MRA處理
用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處理細胞,每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細胞純潔健康,效果好。
(2) 用清洗純化法清除支原體污染的方法
細胞營養(yǎng)馴化→細胞群的篩選→細胞清洗→反復(fù)離心洗滌。
其原理是利用離心力、細胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低限.
如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用,可達到更好的效果。
(3) 藥物輔助加溫處理
先用藥物處理后,再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時,可殺死支原體,但對細胞有不良影響。
(4) 使用支原體特異性血清
用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染,因特異抗體可抑制支原體生長,故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性,并且5個月后仍為陰性。
但此法比較麻煩,不如用抗生素方便、經(jīng)濟。
(二)污染的預(yù)防
預(yù)防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法。只有預(yù)防工作做在前,才能將發(fā)生污染的可能性降到小程度。
一般預(yù)防可從以下幾方面著手:
1、添加抗生素
2、從物品、用品消毒滅菌著手
細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要*,各種溶液滅菌除菌要仔細,并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。
3、從操作者做起
(1) 進無菌室前要用肥皂洗手,按規(guī)定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。
(2) 操作者動作要輕,必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話,若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。
(3) 操作時要常更換吸管,一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實驗完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。
4、防止細胞交叉污染
(1) 在進行多種細胞培養(yǎng)操作時,所用器具要嚴格區(qū)分。
(2) 在進行換液或傳代操作時,注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口,以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。 '
(3) 細胞一旦購置或從別處引入,均應(yīng)及早留種凍存,一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng)。
5、無菌室的*消毒
(1) 0.1%新潔爾滅全面*擦洗無菌室;
(2) 甲醛熏蒸法:甲醛是一種廣譜滅菌劑菌,其水溶液和氣休對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。
(3) 細胞培養(yǎng),首先要避免污染,但在細胞培養(yǎng)過程中,有了污染用適當?shù)姆椒ㄇ宄?,這樣也可以保證細胞培養(yǎng)的成功。